Удосконалення експериментальних моделей інфекційних запальних процесіврізної етіології сечостатевої системи жінок

Підписуйтесь на наші соціальні мережі, щоб стежити за останніми новинами тут 💜:

Сайт: www.ediens.me

Facebook: www.facebook.com/profile.php?id=61561258499410  

LinkedIn: www.linkedin.com/ediens 

Instagram: www.instagram.com/ediens_official

TikTok: www.tiktok.com/@ediens_official 

© Т.В. Мелешко, С.Ю. Боршош, Р.О. Рукавчук, О.В. Цмур, Н.В. Бойко, 2019

УДК 618.1:616.6:613 616.9

Удосконалення експериментальних моделей інфекційних запальних процесів

різної етіології сечостатевої системи жінок

Т.В. Мелешко1,2, С.Ю. Боршош1,3, Р.О. Рукавчук1,2, О.В. Цмур2

, Н.В. Бойко1,2

1Ужгородський національний університет, стоматологічний факультет, кафедра клініко-

лабораторної діагностики та фармакології;

2НДНЦ Молекулярної мікробіології та імунології слизових оболонок;

3 ФПО Кафедра акушерства та гінекології на базі УМПБ ДВНЗ «Ужгородський національний

університет», Ужгород

Завдяки великому розвитку і незалежних від культивування мікроорганізмів (генетичних) методів досліджень вагінальний мікробіом, як і основні коменсали сечостатевої системи людини, на сьогодні є більш вивченими. За останніми даними виділяють різні види локальних, у тому числі і вагінальних мікробіомів. Типовим для нормального мікробіому європейських і азіатських жінок є так звана (Lactobacillus-) як домінувальна вагінальна мікробіома. Однак відомо, що у здорових жінок афроамериканського та іспанського походження у вагінальних мікробіомах переважають представники родів Atopobium, Corynebacterium, Anaerococcus, Peptoniphilus, Prevotella, Gardnerella, Sneathia, Eggerthella, Mobiluncus, Finegoldia, функціональність яких є подібною, оскільки вони теж здатні до гомо- чи гетероферментативного бродіння з кислотоутворенням [1]. Попередні дослідження дали можливість висунути гіпотезу, що мікробіоми з недомінуючим лактобацилярним компонентом мають здатність створювати і підтримувати здорове функціонування екосистеми без патогенного впливу окремих її представників за рахунок утворення нових функціональних асоціацій мікроорганізмів.  З огляду на те, що інфекційні захворювання сечостатевої системи характеризуються сильною індивідуальною ва- ріабельністю і які виникають внаслідок порушення співвідношення між коменсальними та патогенними мікрооргані- змами, метою нашої роботи було розроблення нових інфекційно-запальних експериментальних моделей.  Ключові слова: вагінальний мікробіом експериментальні моделі, коменсальні мікроорганізми. Improvement of experimental models of infectious inflammatory processes of different etiology of the genitourinary system of women T.V. Meleshko1.2, S.Yu. Borshosh1.3, R.O. Rukavchuk  1.2, O.V. Tsmur2  , N.V. Boyko1.2  1Uzhhorod National University, Faculty of Dental Medicine, Department of Clinical and Laboratory Diagnostics and Pharmacology, Uzhhorod; 2NDSC Molecular Microbiology and Immunology of Mucous membranes, Uzhhorod National University, Uzhhorod; 3FPO Department of Obstetrics Gynecology on the basis of UHMBE of Uzhhorod National University  Abstract  Due to the great development and independent of the cultivation of microorganisms (genetic) methods of research, the vaginal microbiome, as well as the major commensals of the urinary-genital system of the person, are now more studied. According to recent data, there are different types of local, including vaginal microbiome. Typical of the normal microbiome of European and Asian women is the so-called (Lactobacillus-), which is the dominant vaginal microbiota. However, it is known that healthy women of African American and Spanish origin in the vaginal microbiome are dominated by representatives of the genera Atopobium, Corynebacterium, Anaerococcus, Peptoniphilus, Prevotella, Gardnerella, Sneathia, Eggerthella, Mobiluncus, Finegoldia, as they may be or hetero-enzymatic fermentation with acid formation [1]. Previous studies have suggested that microbiomes with a non-dominant lactobacillary component have the ability to create and maintain healthy ecosystem functioning without the pathogenic influence of individual representatives through the formation of new functional associations of microorganisms. Considering that infectious diseases of the genitourinary system are characterized by strong individual variability and arising from the violation of the ratio between commensal and pathogenic microorganisms, the aim of our work was to develop new infectious-inflammatory experimental models. Key words: vaginal microbe experimental models, commensal microorganisms  Вступ. Зміна вагінальної екосистеми у євро- пейських жінок із превалюванням умовно- патогенної мікробіоти на фоні відсутності лакто- бацилярних представників може призвести до від- чутних проблем зі здоров’ям. За умови появи сим- птомів, які свідчать про виникнення бактеріальних  вагінозів (БВ), необхідною є їх терапевтична коре- кція. Згідно з критеріями Нюджента, Амселя та  Кіра БВ характеризується різким зменшенням або  відсутністю лактобактерій із їхньою заміною на  полімікробні асоціації анаеробів та гарднерел, го- могенними виділеннями з піхви, підвищенням рН  вагінального секрету і позитивним амінним тестом.  БВ характеризується надзвичайною варіа- бельністю нозологій і, відповідно, різною тяжкіс- тю перебігу супутніх чи опосередкованих гінеко- логічних або акушерських ускладнень, зумовлюю- чи найчастіше запальні процеси в органах тазу  ВНУТРІШНІ ХВОРОБИ  Науковий вісник Ужгородського університету, серія «Медицина», випуск 1 (59), 2019 р. 71  жінок будь-якого віку, інфікування (у випадку хі- рургічних втручань), безплідність і дострокові по- логи у вагітних [2].  Виявлені і проліковані антибіотиками БВ ха- рактеризуються рецидивами за рахунок фор- мування антибіотикорезистентних штамів. Без- симптомні БВ часто завершуються кандидозами,  що є наслідком зменшення кількості лактобактерій, порушення локальної опірності слизових оболонок і зниження рН вагінального секрету менше 4,5. Іншими словами, БВ є клінічним терміном, що описує такі зміни у складі вагінальної мікробіоти, які призводять в кінцевому результаті до повного  руйнування чи дисфункції керованої лактобак- теріями (визнаний регулятор і коменсал) вагіналь- ної колонізаційної стійкості до контамінації пато- генними та умовно-патогенними мікроорганізма- ми. Це стан, коли бактерії роду Lactobacillus сут- тєво зменшені кількісно або не виявляються вза- галі, їхні адгезивні властивості порушені, тоді як  анаеробна компонента мікробіоти навпаки збіль- шується на порядки, і, в першу чергу, за рахунок  антибіотикорезистентних, які саме тому і вважа- ються індикаторними, штамів мікроорганізмів –  Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis, Prevotella, Bacteroides, і Porphyromonas species (Mycoplasma hominis, Mobiluncus), що, безперечно, зумовлено глибокими фізико-хімічними та імунними змінами секрету піхви і заселенням її слизових оболонок цілою низкою умовно-патогенних бактерій і мікроскопічних грибів [3,4]. Необхідно і враховувати наявність інших  небажаних змін вагінальної мікробіоти, які кла- сифікують як аеробні вагініти [5], хоча  насправді мова йде про вагінальний дисбіоз, який, згідно з нашими і новими уявленнями, є наслідком зменшення різноманіття і кількості вагінальних коменсалів і веде до заміни та збільшення кількості інших мікроорганізмів.  Тому важливим є не лише збільшення або ефек- тивна колонізація лактобактеріями, а й одно- часне зменшення кількості БВ-індикаторних  мікроорганізмів, тобто важливим є формування і  підтримка здорового індивідуального мікробно- го ценозу піхви в цілому.  Якщо у невагітних жінок БВ є небезпечним для  їхнього власного здоров’я, викликаючи захво- рювання зовнішніх статевих органів, позаматкової  вагітності та безплідності, то у вагітних ці умовно- патогенні мікроорганізми зумовлюють чи можуть  бути причиною абортів, спонтанних передчасних  викиднів, внутрішньоплодового інфікування і за- тримки розвитку плода. Саме тому потрібно  підтримувати нормальний мікробний баланс. Насамперед, вагітним і тим жінкам, які планують вагітність.  БВ, як правило, ініційовані послабленням ло- кального імунітету, що спричинює активацію і  поширення латентних вірусних інфекцій та тих збудників, що передаються статевим шляхом –  гонококові, хламідійні, трихомонадні та онко- і папіломавірусні і ВІЛ-інфекції тощо [3,5]. Як правило, можна вважати, що штами A.  vaginae характеризуються стійкістю до метроніда- золу і множинною стійкістю до інших антибіотиків.  Вчасна ідентифікація A. vaginae дозволить уник- нути неефективного лікування та зменшити кіль- кість рецидивів і хронізації інфекційно-запальних  процесів урогенітального тракту. Згідно з клінічни- ми дослідженнями [6], кліндаміцин має більш висо- ку активність по відношенню до G. vaginalis та  А. vaginae, ніж метронідазол. Зареєстрована тен- денція більшої чутливості вищезазначених культур  до антибіотиків першого покоління. Ефективність застосування антибіотиків, а відтак і рівні розвитку БВ, залежить від стійкої  персистенції A. vaginae, яка в свою чергу си- нергідно пов’язана з колонізацією слизових обо- лонок піхви штамами G. vaginalis.  Можна вважати другим визначальним факто- ром прогресування БВ є дозо-залежна патогно- монічна особливість, а саме – заміна «пристінко- вого шару» лактобактерій, що демонструють  нерівномірний тип прикріплення і планктонний ріст, на типову щільну біоплівку, яка складається на 60-95 відсотків з G. vaginalis і до 40 відсотків A.  vaginae [7], і саме це збільшує їх стійкість до ан- тибіотиків [8]. У той самий час виявлено їхню чут- ливість до субтилозину А, бактеріоцину, продуко- ваного Bacillus subtilis [9]. Застосування пробіо- тиків з метою лікування вагінозів різної етіології  сьогодні набуває все більшого поширення і часто забезпечує очікувані результати за умови їхнього правильного використання [10,11,12]. Іноді висновки про незначну чи недостатню ефективність біопрепаратів і, зокрема, пробіотиків базуються на результатах, одержаних внаслідок  їхнього неадекватного призначення, коли необ- хідним є паралельне застосування антибіотиків. З  іншого боку, завжди виникає питання, який саме пробіотичний препарат доцільно призначити при тій чи іншій нозології та специфічній мікробіоті  піхви і який саме метод краще обрати для застосу- вання гінекологічних бактеріальних препаратів –  вагінальний чи пероральний? Одним із найбільш вживаних пробіотичних препаратів, ефективність яких підтверджено клінічно для лікування БВ, є Лактогін, до складу якого входять два штами лактобактерій із високою  адгезивною властивістю, ізольованих із мікробно- го ценозу піхви здорових жінок (L. rhamnosus GR –  1 і L. reuteri RC – 14). У той самий час наявні дані  про відносно низьку колонізаційну здатність кап- сул для вагінального застосування Lactin-V (в ос- нові штам L. сrispatus).  Більше про приклади застосування пробіотиків  у гінекологічній практиці можна знайти у до- слідженнях інших авторів [14,15].  Бактеріальні патогени розвинули, набули і успішно використовують широкий арсенал стра-  ВНУТРІШНІ ХВОРОБИ  72 Науковий вісник Ужгородського університету, серія «Медицина», випуск 1 (59), 2019 р. тегій для успішної колонізації слизових оболонок  людини, незважаючи на наявність множинних за- хисних механізмів організму господаря. Іншими  словами, вони характеризуються унікальними вла- стивостями для проникнення через внутрішні за- хисні бар’єри (непроникні епітеліальні оболонки,  муциновий шар) шляхом прилипання, адгезії і навіть розмноження клітин господаря [12].  Доведено, що саме кишкова мікробіота є регу- лятором мікробної транслокації і проникності  кишкового бар’єру. Тому саме пробіотичні препа- рати є перспективними для превенції транслокації,  також вона служить для попередження виникнен- ня хронічного стресу, індукованого в експеримен- тальних тварин [16].  Більшість клінічних даних переконують про  здатність перорально введених лактобацил попе- реджувати транслокацію патогенних бактерій [17],  свідчать про доцільність саме такого застосування препаратів на їхній основі у порівнянні з внутрішньовагінальним, яке не завжди приводить до очікуваних результатів. Матеріали та методи. Для одержання даних  про спектр мікроорганізмів, що є типовими збуд- никами інфекційно-запальних хвороб сечостатевої  системи людини, нами обстежено 25 жінок із ознаками пієлонефритів, уретритів, циститів та вагінітів тощо.  Мікробіологічне обстеження хворих було про- ведено шляхом класичного бактеріологічного  посіву з використанням селективних хромогенних  середовищ (Sigma-Aldrich) і визначенням видової належності за допомогою типових тест-систем (API, bioMerieux, France та Enterotest 23, Erba  Lachema, Brno, CZ), а також методом ПЛР у ре- жимі реального часу за допомогою тест-системи  Фемофлор 16 (ДНК-технологія, Росія) на ам- пліфікаторі ДТ-96 (ДНК-технологія, Росія). Поста- новку аналізу ПЛР проводили згідно з інструкцією  виробника [18]. Для експрес ідентифікації всі мікроорганізми висівали на хромогенне середовище URI-select  (виробник Bio-Rad, США). Попередню іденти- фікацію ізольованих мікроорганізмів здійснювали  за допомогою біохімічних тест-систем ANAERO- 23, ENTERO-24, NEFERM-test, Candida-23,  STAPHY-16 (виробник LACHEMA, Brno) та API® тест-систем API® CHL-50, API® 20E, API® AUX  (виробник Biomerieux, Франція). Для видової іден- тифікації стафілококів, стрептококів, ентерококів  використовували латексні моноклональні сироват- ки Pastorex ® Staph-Plus та Pastorex ® Strep (виро- бник Bio-Rad, США).  Результати досліджень та їх обговорення. У результаті обстеження вагінальних секретів жінок із загальним діагнозом вагініт, що включає в себе різні нозологічні групи з доведеною нами клінічно  етіологічною роллю наведених нижче мікроор- ганізмів, ізольовано типові умовно-патогенні та  коменсальні мікроорганізми і охарактеризовано  індивідуальні і типові профілі виявлених вагіналь- них мікробіомів.

Як видно із наведених у таблиці 1 даних, в ос- новному трапляються такі профілі вагінальних  мікробіомів.  У першій нозологічній групі спостерігалось пе- реважання кокових форм за відсутності лакто- і  біфідобактерій, мікроорганізмів роду кандіда, уре- аплазм, і мікоплазм, а також індикаторів вагінітів –  Atopobium vaginae. Друга нозологічна група характеризувалась  переважанням грамнегативних бактерій за при- сутності лакто-, біфідобактерій та кандид, за  відсутності кокових форм та уреаплазм, міко- плазм, а також індикаторів вагінітів – Atopobium  vaginae.  У свою чергу, третя нозологічна група характе- ризувалась переважанням грамнегативних бакте- рій за відсутності лакто-, біфідобактерій та кандид,  кокових форм та уреаплазм, мікоплазм, а також індикаторів вагінітів – Atopobium vaginae. Переважання мікроорганізмів роду кандіда,  кокових форм за відсутності лакто-, біфідобак- терій, а також за присутності уреаплазм, міко- плазм, а також індикаторів вагінітів – Atopobium  vaginae спостерігалось у четвертій нозологічній групі.  П’ята нозологічна група включала мікрооргані- зми роду кандіда, при відсутності лакто-, біфідо- бактерій, уреаплазм, мікоплазм, а також індикато- рів вагінітів – Atopobium vaginae.  Шоста нозологічна група характеризувалась  переважання мікроорганізмів роду кандіда та ко- кових форм, за відсутності лакто-, біфідобактерій,  уреаплазм, мікоплазм, а також індикаторів вагіні- тів – Atopobium vaginae.  У сьомій нозологічній групі домінували мікро- організми роду кандіда, за наявності лакто- і біфі- добактерій та за відсутності кокових форм, уреа- плазм, мікоплазм, а також індикаторів вагінітів –  Atopobium vaginae.  У восьмій нозологічній групі переважали грам- негативні бактерії за присутності лакто-, біфідоба- ктерій, за відсутності кокових форм, мікроорганіз- мів роду кандіда, уреаплазм, мікоплазм, а також  індикаторів вагінітів – Atopobium vaginae. Дев’ята нозологічна група характеризувалась переважання кокових форм за присутності лакто-,  біфідобактерій, за відсутності мікроорганізмів ро- ду кандіда, уреаплазм, мікоплазм, а також індика- торів вагінітів – Atopobium vaginae.  У десятій нозологічній групі спостерігалось  переважання кокових форм, грамнегативних бак- терій та мікроорганізмів роду кандіда за присутно- сті лакто-, біфідобактерій, за відсутності уреап- лазм, мікоплазм, а також індикаторів вагінітів –  Atopobium vaginae. У свою чергу, одинадцята нозологічна група характеризувалась переважанням мікроорганізмів роду кандіда за присутності лакто-, біфідобактерій,  за відсутності кокових форм, та за наявності уреа- плазм, мікоплазм, а також індикаторів вагінітів –  Atopobium vaginae. Домінування кокових форм та грамнегативних бактерій за присутності лакто-, біфідобактерій, за  відсутності мікроорганізмів роду кандіда, уреа- плазм, мікоплазм, а також індикаторів вагінітів –  Atopobium vaginae характерно для дванадцятої нозологічної групи. З огляду на те, що інфекційні захворювання сечостатевої системи характеризуються сильною індивідуальною варіабельністю і виникають  внаслідок порушення співвідношення між коме- нсальними та патогенними мікроорганізмами,  нами були розроблені нові інфекційно-запальні  експериментальні моделі. У розроблених моде- лях враховувалось співвідношення як комен- сальних, так і умовно-патогенних представників  вагінального мікробіому. Зокрема, були сфор- мовані такі групи мікроорганізмів: LAB, гриби  роду Candida, грам-позитивні коки родів  Staphylococcus/ Streptococcus/Enterococcus, грам- негативні палички родини Enterobacteriaceae/  Pseudomonas, Mycoplasma/Ureaplasma/ Chlamyd- ia/Trichomonas (рис. 1).  Розроблені експериментальні моделі забезпе- чать стратифікований підхід до лікування пацієн- тів із різними нозологічними інфекційно- запальними захворюваннями сечостатевої системи  та з врахуванням індивідуальних особливостей їх коменсальної мікробіоти. Дані моделі відтворено шляхом використання комбінацій власних коменсальних та актуальних умовно-патогенних мікроорганізмів, ізольованих  нами від пацієнтів з інфекційно-запальними захво- рюваннями сечостатевої системи.  Як видно із вищенаведених схем, були сформо- вані різні близькі до актуальних поєднання мікро- організмів: LAB + / –, Candida + / –, грам- позитивні коки родів Staphylococcus/Streptococcus/  Enterococcus + / –, грам-негативні палички Enterobacteriaceae/Pseudomonas + / –, Mycoplas/- a/Ureaplasma/Chlamydia/ Trichomonas + / –.

Висновки. Із огляду на те, що інфекційні за- хворювання сечостатевої системи характеризу- ються сильною індивідуальною варіабельністю і  виникають внаслідок порушення співвідношення  між коменсальними та патогенними мікроорганіз- мами, нами були розроблені нові інфекційно- запальні експериментальні моделі. В розроблених  моделях враховувалось співвідношення як комен- сальних, так і умовно-патогенних представників  вагінального мікробіому. Зокрема, були сформо- вані такі групи мікроорганізмів: LAB, гриби роду  Candida, грам-позитивні коки родів  Staphylococcus/Streptococcus/Enterococcus, грам- негативні палички родини Enterobacteriaceae/  Pseudomonas, Mycoplasma/Ureaplasma/Chlamydia/ Trichomonas.  Розроблені експериментальні моделі забезпе- чать стратифікований підхід до лікування пацієн- тів із різними нозологічними інфекційно- запальними захворюваннями сечостатевої системи  та з врахуванням індивідуальних особливостей їх коменсальної мікробіоти.  Інформація про конфлікт інтересів. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів при ви- конанні наукового дослідження та підготовці даної статті.  Інформація про фінансування. Автори гарантують, що вони не отримали жодних винагород у будь- якій формі, здатних вплинути на результати роботи. 

ВНУТРІШНІ ХВОРОБИ  Науковий вісник Ужгородського університету, серія «Медицина», випуск 1 (59), 2019 р. 77  Список використаної літератури  1. Ma B, Forney LJ, Jacques R. The vaginal microbiome: rethinking health and diseases. Annu Rev Microbiol. 2012;66:371-89. 2. Allsworth JE, Peipert JF. Prevalence of bacteri- al vaginosis. Obstet Gynecol. 2007;109(1):114–20. 3. Verstraelen H. Cutting edge: the vaginal microflora and bacterial vagi- nosis. Verh K Acad Geneeskd Belg. 2008;70(3):147-74. 4. Witkin SS, Linhares IN, Giraldo P, Ledger WJ. An altered immunity hypothesis for the development of symptomatic bacterial vaginosis. Clin Infect Dis. 2007;44(4):554-57. 5. Dondersa GG, Vereeckenb A., Bosmans E. et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 2002;109:34-43.  6. De Backer E, Verhelst R, Verstraelen H. et al. Antibiotic susceptibility of Atopobium vaginae. BMC Infec- tious Diseases. 2006;5:51.  7. Swidsinski A., Mendling W, Loening-Baucke V, et al. Adherent biofilms in bacterial vaginosis. Obstet Gy- necol. 2005;106:1013-23.  8. Swidsinski A. An adherent Gardnerella vagina/is biofilm persists on the vaginal epithelium after standard therapy with oral metronidazole. Am J Obstet Gynecol. 2008;198:1-6.  9. Turovskiy Y, Cheryian T, Algburi A et al. Susceptibility of Gardnerella vaginalis Biofilms to Natural Anti- microbials Subtilosin, еPoly-LLysine, and Lauramide Arginine Ethyl Este. Infectious Diseases in Obstetrics and  Gynecology. 2012;17:284762. 10. MacPhee RA, Hummelen R, Bisanz JE et al. Probiotic strategy for the treatment and prevention of bacterial vaginosis. Expert Opin Pharmacother. 2010;11(18:2985-95.  11.Reid G, Dols J, Miller W. Targeting the vaginal micro- biota with probiotics as a means to counteract infec- tions. Curr Opin Clin Nutr Met Care. 2009;12:583-87.  12.Ribet D, Cossart P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 2015;17:173-83. 13. Voronyn KV, Nakhla BS, Chuiko VI. ta in. Bakteryalnыi vahynoz beremennыkh: эtyolohycheskaia dyahnostyka, prohnozyrovanye y pryntsypы aktyvnoi profylaktyky ynfektsyonnыkh y prenatalnыkh oslozhnenyi. Tavrycheskyi medyko-byolohycheskyi vestnyk. 2012;15(2(1 (58))):40-43. [In Russian]. 14. Kyra EF. Probyotyky v hynekolohycheskoi praktyke. ROAH 2008;3:6-11. [In Russian]. 15. Zareie M, Johnson-Henry K, Jury J et al. Probiotics prevent bacterial translocation and improve intestinal barrier function in rats following chronic psychological stress. Gut. 2006;55:1553-60. 16.Jeppsson B. Bacterial translocation: impact of probiotics / B. Jeppsson, P. Mangell, D. Adawi, G. Molin // Scandinavian Journal of Nutrition. – 2004. – No 48. – Vol. 1. – P. 37–41.  17. Tsmur OV, Levchuk OB, Liashyna KV, Boiko NV. Rezultaty zastosuvannia vitchyznianoho synbiotyku Bi- fiten dlia terapii bakterialnykh vahinoziv u vahitnykh. Zdorov’ia zhinky. 2016;6(112):70-75. [In Ukrainian].  18. Femoflor. Ynstruktsyia po prymenenyiu nabora reahentov dlia yssledovanyia byotsenoza urohenytalnoho trakta u zhenshchyn metodom PTsR v rezhyme realnoho vremeny // Elektronnyi resurs: http://dnatechnology.ru/files/images/instructions_rus/fem oflor/119-8_s b_24-06-14.pdf. [In Russian]. Стаття надійшла до редакції: 27.02.2019 р.